軟瓊脂克隆形成實驗

軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗(Anehorage-independentassay）。利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質(zhì)，使細胞在懸浮狀態(tài)下生長。軟瓊脂克隆形成實驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。軟瓊脂培養(yǎng)法常用檢測腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞系。

操作流程

1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂（Agarose 加蒸餾水配置），高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當天微波爐或烘箱加熱融化，置于37攝氏度培養(yǎng)箱中。

2.鋪下層膠：按1：1比例混勻1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2mL混合液，在室溫條件下等待冷卻凝固。

3.取對數(shù)生長期細胞，消化配置成單細胞懸液，計數(shù)后將細胞數(shù)調(diào)整為5*10^4/mL。

4.鋪上層膠：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培養(yǎng)基混勻，取2mL混合液于EP管中，向管中加入10-20微升細胞懸液，充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中，待上層瓊脂凝固后，放在37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，每三天向孔板中加入200微升培養(yǎng)基。

5.顯微鏡下拍照，統(tǒng)計克隆直徑并作圖。

以下述為例：

116-con：1.2*10^6

116-OE：1.1*10^6

將細胞配置成5*10^4/mL

116-con：42+958培養(yǎng)基

116-OE：45+955培養(yǎng)基

注意事項

1.細胞一定要吹打分散成單細胞懸液

2.接種時細胞密度不可過高

3.軟瓊脂與細胞混合時溫度不可超過40攝氏度，容易燙傷甚至燙死細胞。

4.軟瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定，反復加熱容易降解并產(chǎn)生毒性，且容易造成硬度下降，因此需要高壓滅菌后進行分裝。

5.鋪板操作時速度要快，以免造成局部凝固。

耗材：